本篇文章為大家展示了如何使用CIRI識(shí)別環(huán)狀RNA，內(nèi)容簡(jiǎn)明扼要并且容易理解，絕對(duì)能使你眼前一亮，通過這篇文章的詳細(xì)介紹希望你能有所收獲。

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在最初的環(huán)狀RNA研究中，認(rèn)為環(huán)狀RNA都是由exon通過反向剪切構(gòu)成的,稱之為exonic circRNA，只有這樣的環(huán)狀RNA能夠由PCR反應(yīng)驗(yàn)證出來的。

CIRI是一款環(huán)狀RNA檢測(cè)軟件，通過該軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，學(xué)者第一次用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出了intronic circRNA和intergenic circRNA。該軟件操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，是非常流行的一款環(huán)狀RNA檢測(cè)軟件。

該軟件至少需要兩個(gè)輸入文件，基因組的fasta序列和測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)產(chǎn)生的sam文件，需要注意的是，輸入的sam文件必須是由bwa-mem算法比對(duì)產(chǎn)生的 。分析的pipeline示意如下

對(duì)于輸入的sam文件，需要經(jīng)過兩次掃描，在第一次掃描時(shí)，根據(jù)雙端數(shù)據(jù)的比對(duì)情況篩選候選的環(huán)狀RNA，這一步通過判斷SAM文件中CIGAR那一列的值來實(shí)現(xiàn)，本質(zhì)上是檢測(cè)覆蓋環(huán)狀RNA連接點(diǎn)處的junction reads,根據(jù)測(cè)序讀長(zhǎng)和連接點(diǎn)處包含的基因組區(qū)域的特征，分成以下3種模型

圖A表示junction read只覆蓋了起始外顯子和終止外顯子的部分序列，這兩部分reads在基因組上的比對(duì)位置是相反的，絕大部分的環(huán)狀RNA都符合這種模型。

圖B表示junction read除了覆蓋了起始外顯子和終止外顯子的兩部分序列外，還覆蓋了中間的一個(gè)外顯子的部分序列，這種情況下reads可以分成3個(gè)部分比對(duì)到基因組上。

圖C表示junction read除了覆蓋了整個(gè)環(huán)狀RNA外，還重復(fù)又讀了一部分序列，這個(gè)只有當(dāng)環(huán)狀RNA的序列長(zhǎng)度小于測(cè)序讀長(zhǎng)時(shí)才可能出現(xiàn)。

該軟件將以上3種模型定義為paired chiastic clipping signals，簡(jiǎn)稱PCC信號(hào)，如果一條reads比對(duì)情況符合以上任意一種，就認(rèn)為該reads是一條環(huán)狀RNA的junction reads。

為了提高準(zhǔn)確性，識(shí)別到j(luò)unciton reads之后，還會(huì)結(jié)合雙端序列比對(duì)的質(zhì)量paired end mapping即PEM和GT-AG保守的剪切位點(diǎn)進(jìn)行過濾，示意圖如下

只保留比對(duì)質(zhì)量較高，且頭尾符合AG-GT剪切信號(hào)的junciton reads進(jìn)入下游分析，在第二次掃描SAM文件的過程中，通過動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法給出最終的環(huán)狀RNA預(yù)測(cè)結(jié)果，如果提供了GTF文件，還會(huì)對(duì)環(huán)狀RNA進(jìn)行注釋。

該軟件的使用步驟如下

1. bwa比對(duì)參考基因組

代碼如下

bwa mem \
-T 19 \
-t 5 hg19_index \
R1.fastq.gz R2.fastq.gz \
> align.sam

2. 運(yùn)行CIRI

CIRI2.pl  \
-T 20 \
-F hg19.fa \
-A hg19.gtf \
-I align.sam \
-O circRNA.xls

輸出結(jié)果如下所示

在后續(xù)驗(yàn)證時(shí)，可以挑選表達(dá)量較高的來驗(yàn)證，在軟件對(duì)應(yīng)的文章中，挑選了junction reads數(shù)大于5的環(huán)狀RNA來進(jìn)行驗(yàn)證。

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