來源：奇點(diǎn)網(wǎng)

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搓搓手，今天基因編輯技術(shù)又登上一個新臺階了！

這次迎來解答的是CRISPR也沒搞定的歷史遺留難題——對線粒體DNA的精準(zhǔn)編輯。

今日，《自然》雜志刊登了一項(xiàng)新研究，科學(xué)家們利用一種細(xì)菌毒素DddA開發(fā)了針對線粒體DNA的單堿基編輯器DdCBE，可直接針對雙鏈DNA將C-G堿基對編輯為T-A堿基對，而且編輯效率很高，也幾乎沒有脫靶效應(yīng)。該研究通訊作者為劉如謙和Joseph D。 Mougous。

看完論文不禁感嘆，這個編輯器真是精妙極了，人類的智慧牛逼（為劉老師打電話——

圖源 | science.com

DddA是一種細(xì)菌毒素，最開始是通訊作者之一、微生物學(xué)家Mougous團(tuán)隊(duì)中一位博士后Marcos de Moraes發(fā)現(xiàn)的。2018年，de Moraes發(fā)現(xiàn)DddA具有催化胞嘧啶脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ幕钚?，而且有意思的是，與其他的脫氨酶不同，這種作用可以直接在DNA雙螺旋上發(fā)生，不需要解旋。

Mougous當(dāng)時就想到了只聞其名未曾謀面的同事劉如謙。劉如謙團(tuán)隊(duì)之前開發(fā)的CRISPR單堿基編輯器中就有用到過脫氨酶，或許DddA也能夠在相關(guān)的領(lǐng)域得到應(yīng)用。

經(jīng)過郵件溝通，兩個團(tuán)隊(duì)一拍即合。

不過他們一致認(rèn)為，就算用DddA再造新的CRISPR單堿基編輯器，也不會比現(xiàn)有的技術(shù)有太多的優(yōu)勢，所以研究者們一開始就瞄準(zhǔn)了新的應(yīng)用場景——線粒體DNA編輯。

對線粒體DNA的精準(zhǔn)編輯是從來沒人實(shí)現(xiàn)過的，現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的CRISPR技術(shù)面對線粒體DNA也是束手無策——線粒體沒有吸收RNA的機(jī)制，所以CRISPR技術(shù)關(guān)鍵的gRNA根本就進(jìn)不去線粒體。

那么其他的基因編輯技術(shù)呢？

2018年，《自然醫(yī)學(xué)》雜志曾同期發(fā)表了兩篇論文，分別利用鋅指蛋白核酸酶技術(shù)（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣因子核酸酶技術(shù)（TALENs）實(shí)現(xiàn)了對線粒體DNA突變的消除。不過這兩項(xiàng)技術(shù)能做的，是將攜帶突變的線粒體DNA直接降解，其實(shí)應(yīng)用起來難度很大。畢竟線粒體DNA的拷貝數(shù)如果太低，也會帶來疾病。

這樣一看，DddA的潛力還真是挺大。它本身是個蛋白，能夠進(jìn)入線粒體，又可以直接對雙鏈DNA編輯，簡直非常值得研究一番。

DddA的三維構(gòu)象

當(dāng)然了，到這里還只是剛剛有了一個思路，其實(shí)從DddA到最終的DdCBE，要解決的問題還有三個。

第一，不管怎么說，胞苷脫氨酶對哺乳動物細(xì)胞來說是有生物毒性的。為了避免這種毒性，研究者們想出的辦法是把DddA一拆兩半，兩個沒有活性的部分在編輯位點(diǎn)重組恢復(fù)脫氨活性。不知道研究者們是不是從ZFN和TALEN中獲得的靈感呢。

TALE能夠識別特定的DNA序列，將設(shè)計(jì)好的TALE蛋白與半個DddA相連，這樣DddA們就能夠在編輯位點(diǎn)重逢了。

第二，怎么讓組合好的DddA進(jìn)入線粒體呢？這個問題倒是不難解決，在ZFN和TALEN中也有答案，加上線粒體靶向信號（MTS）蛋白序列，就能夠利用線粒體的蛋白質(zhì)吸收機(jī)制穿過線粒體的雙層膜了。

第三，DddA作為一種胞苷脫氨酶，它能夠做的是將胞嘧啶（C）脫氨變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而U是RNA堿基，出現(xiàn)在DNA中很容易被尿嘧啶-DNA糖基化酶切掉，又恢復(fù)成C。

為了保住DddA的作用不被干擾，還要再加上尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI），把U保住，等到下一輪DNA復(fù)制，它就可以和腺嘌呤（A）互補(bǔ)而不是和鳥嘌呤（G）互補(bǔ)。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，加入UGI之后編輯效率提高了8倍。

至此為止，DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器（DdCBE）才徹底完成了。簡單總結(jié)一下，這個DdCBE包含四個部分：進(jìn)入線粒體的向?qū)TS、協(xié)助識別DNA靶點(diǎn)的TALE蛋白、編輯主力軍DddA（半個）以及UGI。

DdCBE結(jié)構(gòu)

研究者嘗試編輯了幾個不同的線粒體基因，編輯效率大約在4.6%到49%之間，影響因素包括兩個半個DddA的方向、TALE蛋白設(shè)計(jì)、兩個亞基之間的間隔、靶點(diǎn)和TALE的相對結(jié)合位置等。

至于基因編輯中最受關(guān)注的脫靶效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)給出的結(jié)論是對細(xì)胞核基因沒有脫靶，線粒體DNA脫靶效應(yīng)很少，主要與TALE有關(guān)。

在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，DdCBE的編輯活性能夠持續(xù)18天，其間對線粒體DNA的編輯沒有降低細(xì)胞存活率、沒有產(chǎn)生大的DNA片段缺失、也沒有影響DNA拷貝數(shù)。

理論上來說，DdCBE有希望解決目前一半的線粒體DNA突變，就算不能夠修正全部突變，只是減少有害突變拷貝的數(shù)量，對于線粒體疾病也是能夠起到治療效果的，可以說DdCBE是線粒體疾病基因療法的一大進(jìn)步，同時也是研究線粒體基因組的有力工具。

標(biāo)題名稱：基因編輯獲重大突破！首次實(shí)現(xiàn)線粒體DNA的精準(zhǔn)編輯
文章URL：http://jinyejixie.com/article30/cpheso.html

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